ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ એ એક પરોપજીવી જીવ છે જે ગિઆર્ડિઆસિસનું કારણ બને છે, આંતરડાનો ચેપ ખાસ કરીને નાના બાળકોમાં ઝાડાના ક્લિનિકલ સંકેતો સાથે સામાન્ય છે.અમે અગાઉ જાણ કરી છે કે એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર ઓલિગોમેરાઇઝેશન-જેવા રીસેપ્ટર 3 (NLRP3) બંધનકર્તા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સના સક્રિયકરણને ટ્રિગર કરે છે અને એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર વેસીકલ (EV) સ્ત્રાવ દ્વારા હોસ્ટ બળતરા પ્રતિક્રિયાઓનું નિયમન કરે છે.જો કે, આ પ્રક્રિયામાં સામેલ પેથોજેન-સંબંધિત ડ્યુઓડેનોકોકલ ઇવી (જીઇવી) ની ચોક્કસ મોલેક્યુલર પેટર્ન અને ગિઆર્ડિઆસિસમાં એનએલઆરપી3 બળતરાની ભૂમિકા સ્પષ્ટ કરવાની બાકી છે.
GEV માં રિકોમ્બિનન્ટ યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન બનાવવામાં આવ્યા હતા, માઉસના પ્રાથમિક પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજેસમાં ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને બળતરાના લક્ષ્ય પરમાણુ કેસ્પેસ-1ને માપીને શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા.p20 અભિવ્યક્તિ સ્તરની તપાસ કરવામાં આવી હતી..G. duodenalis alpha-2 અને alpha-7.3 giardines મૂળરૂપે NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 અને caspase-1 p20), IL સ્ત્રાવને માપવા દ્વારા ઓળખવામાં આવ્યા હતા.1β સ્તરો, એપોપ્ટોટિક સ્પોટેડ પ્રોટીન (એએસસી) ઓલિગોમેરાઇઝેશન સ્તરો અને એનએલઆરપી3 અને એએસસીનું ઇમ્યુનોફ્લોરોસન્ટ સ્થાનિકીકરણ.જી. ડ્યુઓડેનાલિસના રોગકારકતામાં NLRP3 બળતરાની ભૂમિકાનું મૂલ્યાંકન પછી ઉંદરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં NLRP3 સક્રિયકરણ અવરોધિત કરવામાં આવ્યું હતું (NLRP3 અવરોધિત ઉંદર) અને શરીરના વજનમાં પેથોલોજીકલ ફેરફારો, ડ્યુઓડીનલ પરોપજીવી લોડ અને ડ્યુઓડીનલ પેશીઓનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.આ ઉપરાંત, અમે તપાસ કરી કે શું હાયર્ડિન આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 એનએલઆરપી3 ઇન્ફ્લેમાસોમ દ્વારા વિવોમાં IL-1β સ્ત્રાવને પ્રેરિત કરે છે અને ઉંદરમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસના રોગકારકતામાં આ પરમાણુઓની ભૂમિકા નક્કી કરી છે.
આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન વિટ્રોમાં એનએલઆરપી3 ઇન્ફ્લેમસોમના સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરે છે.આનાથી p20 caspase-1 નું સક્રિયકરણ થયું, NLRP3, pro-IL-1β અને pro-caspase-1 પ્રોટીનના અભિવ્યક્તિ સ્તરોમાં વધારો, IL-1β સ્ત્રાવમાં નોંધપાત્ર વધારો, ASA ફોલ્લીઓનું નિર્માણ. સાયટોપ્લાઝમ, અને ASA ઓલિગોમેરાઇઝેશનનું ઇન્ડક્શન.NLRP3 બળતરા પેનાઇલ નુકશાન ઉંદરમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસની રોગકારકતાને વધારે છે.NLRP3-અવરોધિત ઉંદરોમાંથી ગેવેજ દ્વારા કોથળીઓ સાથે સારવાર કરાયેલ ઉંદરમાં ટ્રોફોઝોઇટ્સની વધેલી સંખ્યા અને ડ્યુઓડેનલ વિલીને ગંભીર નુકસાન દર્શાવવામાં આવ્યું હતું, જે સંકોચાયેલ અને શાખાઓ સાથે નેક્રોટિક ક્રિપ્ટ્સ દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે.વિવોમાં પ્રયોગોએ દર્શાવ્યું છે કે ગિઆર્ડિન આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 એનએલઆરપી3 ઇન્ફ્લેમાસોમ દ્વારા IL-1β ના સ્ત્રાવને પ્રેરિત કરી શકે છે, અને ગિઆર્ડાઇન્સ આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 સાથે રોગપ્રતિરક્ષા ઉંદરમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસની રોગકારકતામાં ઘટાડો કરે છે.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ અભ્યાસના પરિણામો સૂચવે છે કે ગિઆર્ડિઆ આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 યજમાન NLRP3 બળતરાને અપગ્ર્યુલેશનનું કારણ બને છે અને ઉંદરમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસની ચેપને ઘટાડે છે, જે ગિઆર્ડિઆસિસને રોકવા માટે આશાસ્પદ લક્ષ્યો છે.
ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ એ એક એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર પ્રોટોઝોન પરોપજીવી છે જે નાના આંતરડામાં રહે છે અને વાર્ષિક 280 મિલિયન કેસો ઝાડા સાથે થાય છે, ખાસ કરીને વિકાસશીલ દેશોમાં નાના બાળકોમાં [1].લોકો એમ. ડ્યુઓડેનમ સિસ્ટ્સથી દૂષિત પાણી અથવા ખોરાક પીવાથી ચેપ લાગે છે, જે પછી પેટમાં પ્રવેશ કરે છે અને ગેસ્ટ્રિક જ્યુસમાં વિસર્જન થાય છે.ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ ટ્રોફોઝોઇટ્સ ડ્યુઓડીનલ એપિથેલિયમ સાથે જોડાય છે, જેના કારણે ઉબકા, ઉલટી, ઝાડા, પેટમાં દુખાવો અને વજન ઘટે છે.ઇમ્યુનોડેફિસિયન્સી અને સિસ્ટિક ફાઇબ્રોસિસ ધરાવતી વ્યક્તિઓ ચેપ માટે સંવેદનશીલ હોય છે.ચેપ મૌખિક અને ગુદા મૈથુન દ્વારા પણ થઈ શકે છે [2].મેટ્રોનીડાઝોલ, ટીનીડાઝોલ અને નિટાઝોક્સાનાઈડ જેવી દવાઓ ડ્યુઓડીનલ ચેપ [3] માટે પસંદગીના સારવાર વિકલ્પો છે.જો કે, આ કીમોથેરાપી દવાઓ ઉબકા, કાર્સિનોજેનેસિસ અને જીનોટોક્સિસીટી [4] જેવી પ્રતિકૂળ આડઅસરોનું કારણ બને છે.તેથી, G. duodenalis ચેપને રોકવા માટે વધુ અસરકારક વ્યૂહરચના વિકસાવવાની જરૂર છે.
ઇન્ફ્લેમાસોમ્સ એ સાયટોસોલિક પ્રોટીન સંકુલનો એક વર્ગ છે જે જન્મજાત રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવનો ભાગ છે, જે પેથોજેન આક્રમણ સામે રક્ષણ કરવામાં અને દાહક પ્રતિક્રિયાઓને મધ્યસ્થી કરવામાં મદદ કરે છે [5].આ બળતરામાં, ન્યુક્લિયોટાઇડ-બંધનકર્તા ઓલિગોમેરાઇઝેશન (એનઓડી) રીસેપ્ટર 3 (એનએલઆરપી3) ન્યુક્લિયોટાઇડ-બંધનકર્તા ઓલિગોમેરાઇઝેશન (એનએલઆરપી3) ન્યુક્લિયોટાઇડ-બંધનકર્તા-જેવા બળતરાનો વ્યાપકપણે અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો છે કારણ કે તે વિવિધ પેથોજેન/પેથોજેન પેટર્ન દ્વારા શોધી શકાય છે. DAMP), જન્મજાત રોગપ્રતિકારક શક્તિને ઓળખે છે, સક્રિય કરે છે.અને ઘણા બળતરા રોગોમાં આંતરડાના હોમિયોસ્ટેસિસને નિયંત્રિત કરે છે [6,7,8].તેમાં પેટર્ન રેકગ્નિશન રીસેપ્ટર (PRR) NLRP3, એડેપ્ટર એપોપ્ટોટિક સ્પોટેડ પ્રોટીન (ASC), અને ઇફેક્ટર પ્રોકાસ્પેસ-1 અથવા પ્રોકાસ્પેસ-11નો સમાવેશ થાય છે.NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ પેથોજેન આક્રમણ સામે યજમાન તરીકે કામ કરે છે, જેમ કે નિયોસ્પોરા કેનિનમ [9], પેરાકોસીડીયોઇડ્સ બ્રાઝિલીએન્સિસ [૧૦] અને લીશમેનિયા અભ્યાસમાં જોવા મળે છે.[૧૧], પરંતુ એવું પણ નોંધવામાં આવ્યું છે કે NLRP3 દાહકનું સક્રિયકરણ રક્ષણાત્મક પ્રતિરક્ષા પ્રતિભાવોને મર્યાદિત કરે છે અને રોગની પ્રગતિને વધારે છે, ઉદાહરણ તરીકે, કૃમિમાં [12].અમારા અગાઉના તારણો પર આધારિત, અમે અહેવાલ આપ્યો છે કે એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર જી. ડ્યુઓડેનાલિસ NLRP3 બળતરાના અંતઃકોશિક સક્રિયકરણને ટ્રિગર કરે છે અને એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર વેસિકલ્સ (EVs) [13] સ્ત્રાવ કરીને હોસ્ટ દાહક પ્રતિક્રિયાઓને મોડ્યુલેટ કરે છે.જો કે, વીવોમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપમાં NLRP3 બળતરાની ભૂમિકા નક્કી કરવાનું બાકી છે.
ગિઆર્ડિન્સને મૂળ રીતે જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સાયટોસ્કેલેટનના માળખાકીય ઘટકો તરીકે વર્ણવવામાં આવ્યા હતા અને નાના આંતરડામાં ટ્રોફોઝોઇટ ગતિશીલતા અને ઉપકલા કોષના જોડાણમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે.પર્યાવરણને વધુ સારી રીતે અનુકૂલન કરવા અને તેમની રોગકારકતા વધારવા માટે, જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ટ્રોફોઝોઇટ્સે 8 ફ્લેગેલા, 1 મધ્યમ શરીર અને 1 વેન્ટ્રલ ડિસ્ક [14] સમાવિષ્ટ એક અનન્ય સાયટોસ્કેલેટલ માળખું વિકસાવ્યું હતું.ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમના ટ્રોફોઝોઇટ્સ તેમના સાયટોસ્કેલેટનનો ઉપયોગ નાના આંતરડાના ઉપરના ભાગમાં, ખાસ કરીને ડ્યુઓડેનમમાં પ્રવેશ કરવા માટે કરે છે અને એન્ટરસાઇટ્સ સાથે જોડાય છે.તેઓ સતત સ્થાનાંતરિત થાય છે અને કોષ ચયાપચયનો ઉપયોગ કરીને ઉપકલા કોશિકાઓ સાથે જોડાય છે.તેથી, તેમના સાયટોસ્કેલેટન અને વિરુલન્સ વચ્ચે ગાઢ સંબંધ છે.ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ માટે વિશિષ્ટ ગિઆર્ડિન એ સાયટોસ્કેલેટન માળખાના ઘટકો છે [15] અને ચાર વર્ગોમાં વહેંચાયેલા છે: α-, β-, γ-, અને δ-giardines.α-giardin પરિવારના 21 સભ્યો છે, જે તમામમાં ફોસ્ફોલિપિડ્સ [16] બાંધવાની કેલ્શિયમ આધારિત ક્ષમતા છે.તેઓ સાયટોસ્કેલેટનને કોષ પટલ સાથે પણ જોડે છે.જી. ડ્યુઓડેનાલિસને કારણે ઝાડા ધરાવતા વ્યક્તિઓમાં, α-ગિઆર્ડિન્સ ચેપ દરમિયાન અત્યંત વ્યક્ત અને રોગપ્રતિકારક શક્તિ ધરાવે છે [17].ગિઆર્ડિયા આલ્ફા-1 પર આધારિત હેટરોલોગસ રસીઓ ઉંદરમાં ગિઆર્ડિઆસિસ સામે રક્ષણ આપે છે અને રસીના વિકાસ માટે સંભવિત ઉમેદવાર એન્ટિજેન્સ છે [18].આલ્ફા-8 ગિયાર્ડિન, પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન અને ફ્લેગેલ્લામાં સ્થાનીકૃત છે, પરંતુ વેન્ટ્રલ ડિસ્કમાં નથી, જી. ડ્યુઓડેનાલિસ [19] માં ટ્રોફોઝોઇટ્સની ગતિશીલતા અને વૃદ્ધિ દરને વધારે છે.આલ્ફા-14 ગિઆર્ડિન ફ્લેગેલ્લા પર માઇક્રોટ્યુબ્યુલ સ્ટ્રક્ચર્સ સાથે જોડાય છે અને જી. ડ્યુઓડેનાલિસ [20] ની કાર્યક્ષમતાને અસર કરે છે.આલ્ફા-11 જિયાર્ડિન સમગ્ર જીવન ચક્ર દરમિયાન વિપુલ પ્રમાણમાં હાજર હોય છે, અને આલ્ફા-11 ગિઆર્ડિનનું વધુ પડતું અભિવ્યક્તિ જી. ડ્યુઓડેનાલિસને જ નુકસાન કરે છે [21].જો કે, તે સ્પષ્ટ નથી કે આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપ અને તેમની અંતર્ગત પદ્ધતિઓ સામે રક્ષણાત્મક છે કે કેમ.
આ અભ્યાસમાં, રિકોમ્બિનન્ટ યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine અને pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ને યજમાન NLRP3 ને સક્રિય કરવા માટે માઉસ પ્રાથમિક પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.પછી દાહક લક્ષ્યોની તપાસ કરવામાં આવી હતી.અમે જી. ડ્યુઓડેનાલિસના રોગકારકતામાં NLRP3 બળતરાની ભૂમિકાનું પણ મૂલ્યાંકન કર્યું, તપાસ કરી કે શું આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7,3 ગિઆર્ડિન્સ વિવોમાં NLRP3 બળતરાના સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરે છે, અને નિર્ધારિત કર્યું કે પેથોજેનિકતામાં ગિઆર્ડિન્સની આ બે ભૂમિકાઓ છે. જી. ડ્યુઓડેનાલિસ.અમારું સામાન્ય ધ્યેય જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપના નિવારણ માટે આશાસ્પદ લક્ષ્યો વિકસાવવાનું હતું.
જંગલી પ્રકાર (WT) C57BL/6 5-8 અઠવાડિયાની વયની માદા ઉંદર લિયાઓનિંગ ચાંગશેંગ પ્રાયોગિક પ્રાણી કેન્દ્ર (લિયાઓનિંગ, ચીન) પાસેથી ખરીદવામાં આવી હતી.ઉંદરને પાણીની મફત ઍક્સેસ હતી, તેમને વંધ્યીકૃત ખોરાક મળ્યો હતો અને તેમને 12/12 કલાકના પ્રકાશ/અંધારાના ચક્રમાં રાખવામાં આવ્યા હતા.ચેપ પહેલાં, ઉંદરને એમ્પીસિલિન (1 mg/mL), વેનકોમિસિન (1 mg/mL), અને neomycin (1.4 mg/mL) (બધા શાંઘાઈ, ચીન, કૃત્રિમ સજીવો પાસેથી ખરીદેલા) સાથે પૂરક પીવાના પાણીમાં એન્ટિબાયોટિક્સ એડ લિબિટમ મેળવ્યા હતા [22] ].].24 કલાકથી વધુ સમય માટે ખાવા પીવાની ક્ષમતા ગુમાવનાર અને ≥ 20% શરીરનું વજન ગુમાવનાર ઉંદરોને સર્વાઇકલ ડિસલોકેશન દ્વારા માનવીય રીતે ઇથનાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) 12.5% ​​ફેટલ બોવાઈન સીરમ (FBS; એવરી ગ્રીન, ઝેજીઆંગ, ચાઈના) અને 0.1% બોવાઈન પિત્ત (સિગ્મા-એલ્ડ્રીચ, સેન્ટ મિઝોરી, યુએસએ) સાથે પૂરક હતા. ).યુએસએ) માઇક્રોએરોબિક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ.સંગમિત ટ્રોફોઝોઇટ્સ બરફ પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને વધુ પ્રજનન માટે 1:4 ના ગુણોત્તરમાં પસાર થયા હતા.
ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમના કોથળીઓને અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ પ્રેરિત કરવામાં આવ્યા હતા [23], ટ્રોફોઝોઇટ્સ લઘુગણક તબક્કામાં કાપવામાં આવ્યા હતા અને પછી એન્કેપ્સ્યુલેશન ઇન્ડ્યુસિંગ માધ્યમ, pH 7.1 (સંશોધિત TYI-S-33) સાથે 1 × 106 ટ્રોફોઝોઇટ્સની અંતિમ સાંદ્રતામાં ભળી ગયા હતા.પિત્ત સાંદ્રતા 0.05% મધ્યમ).લઘુગણક વૃદ્ધિના તબક્કા સુધી ટ્રોફોઝોઇટ્સનું સંવર્ધન 37°C પર એનારોબિક પરિસ્થિતિઓમાં કરવામાં આવ્યું હતું.માધ્યમને સિસ્ટ ઇન્ડ્યુસિંગ માધ્યમમાં બદલો (pH 7.8; 1% પિત્ત સાંદ્રતા સાથે સંશોધિત TYI-S-33 માધ્યમ) અને સંસ્કૃતિ G. ડ્યુઓડેનાલિસ 37°C પર 48-96 કલાક માટે, જે દરમિયાન કોથળીઓની રચના માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ જોવા મળી હતી.મોટાભાગના ટ્રોફોઝોઇટ્સને કોથળીઓ બનાવવા માટે પ્રેરિત કર્યા પછી, સંસ્કૃતિના મિશ્રણની લણણી કરવામાં આવી હતી અને બાકીના ટ્રોફોઝોઇટ્સને લીઝ કરવા માટે જંતુરહિત ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી.ઉંદરમાં ગેસ્ટ્રિક ટ્યુબ દ્વારા અનુગામી વિશ્લેષણ માટે સિસ્ટની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને તેને 4°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવી હતી.
ગિઆર્ડિયા એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર વેસિકલ્સ (જીઇવી) અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે સમૃદ્ધ થયા હતા [13].લઘુગણક વૃદ્ધિ તબક્કામાં ટ્રોફોઝોઇટ્સ એક્ઝોસોમ-ક્ષીણ FBS (જૈવિક ઇન્ડસ્ટ્રીઝ, બીટ-હેમેક, ઇઝરાયેલ) સાથે તૈયાર કરાયેલ સંશોધિત TYI-S-33 માધ્યમમાં 1 × 106 પરોપજીવી/mL ની અંતિમ સાંદ્રતામાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 12 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.10 મિનિટ માટે 2000 ગ્રામ, 45 મિનિટ માટે 10,000 ગ્રામ અને 60 મિનિટ માટે 100,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કલ્ચર સુપરનેટન્ટથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.ફોસ્ફેટ બફર સલાઈન (PBS) માં અવક્ષેપ ઓગળવામાં આવ્યા હતા, BCA પ્રોટીન એસે કીટ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, MA, USA) નો ઉપયોગ કરીને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું અને -80 ° સે. પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું અથવા વધુ વિશ્લેષણ માટે સીધું ઉપયોગમાં લેવાય છે.
પ્રાથમિક માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા [24].સંક્ષિપ્તમાં, ઉંદરોને (6-8 અઠવાડિયાની ઉંમરના) ને 2.98% ડિફ્કો લિક્વિડ થિયોગ્લાયકોલ માધ્યમ (BD, ફ્રેન્કલિન લેક્સ, NJ, USA) ના 2.5 મિલી સાથે ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને 3-4 તાળવું ખવડાવ્યું હતું.અસાધ્ય રોગ પછી ઉંદરના પેટની પોલાણમાંથી મેક્રોફેજનું સસ્પેન્શન એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને 10 મિનિટ માટે 1000 ગ્રામ પર 3 વખત સેન્ટ્રીફ્યુગ કરવામાં આવ્યું હતું.CD11b માર્કરનો ઉપયોગ કરીને કોષની શુદ્ધતા >98% ન થાય ત્યાં સુધી લણણી કરાયેલ કોષો ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ 6-વેલ સેલ કલ્ચર પ્લેટ્સ (4.5 x 106 સેલ/વેલ)માં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા અને 37°C પર 10% FBS (બાયોઇન્ડસ્ટ્રી) સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.અને 5% CO2.
TRIzol રીએજન્ટ (Vazyme, Nanjing, China) ના 1 ml માં 1 × 107 ટ્રોફોઝોઇટ્સમાંથી RNA કાઢવામાં આવ્યું હતું, મોનસ્ક્રિપ્ટ dsDNase (મોનાડ, વુહાન, ચાઇના) નો ઉપયોગ કરીને જીનોમિક ડીએનએ કુલ G. ડ્યુઓડેનાલિસ આરએનએમાંથી કાઢવામાં આવ્યું હતું અને પૂરક ડીએનએ (સીડીએનએ) ને સમન્વયિત કરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર MonScript RTIIII સુપર મિક્સ (મોનાડ) નો ઉપયોગ કરીને.
લક્ષ્ય જી. ડ્યુઓડેનાલિસ જનીન માટે સીડીએસ ક્રમની માહિતી NCBI જેનબેંકમાંથી મેળવવામાં આવી હતી.દરેક લક્ષ્ય જનીન માટે વિશિષ્ટ સીમલેસ ક્લોનિંગ પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવા માટે પ્રાઈમર 5.0 નો ઉપયોગ કરો.ફોરવર્ડ પ્રાઈમર (5′-3′) માં ત્રણ ભાગોનો સમાવેશ થાય છે: એક લીનિયરાઈઝ્ડ વેક્ટર pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) સાથે ઓવરલેપિંગ સિક્વન્સ અને કોડન ATG અને GNN શરૂ કરો (જો પહેલો આધાર G ન હોય તો).આ અભિવ્યક્તિની કાર્યક્ષમતા સુધારવા માટે કરવામાં આવે છે.વધુમાં, ઓછામાં ઓછા 16 bp સંયુક્ત પાયા (GC સામગ્રી 40–60%/Tm આશરે. 55 °C).રિવર્સ પ્રાઈમર (5′-3′) બે ભાગો ધરાવે છે, EcoRV-રેખીય વેક્ટર pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) સાથેનો ઓવરલેપિંગ ક્રમ અને ઓછામાં ઓછા 16 bpનો સંયુક્ત આધાર.(છેલ્લા બે સ્ટોપને બાદ કરતાં).પાયા) રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝમિડને તેમના લેબલવાળા પ્રોટીનને વ્યક્ત કરવાની મંજૂરી આપવા માટે AA અથવા GA જેવા કોડન).પ્રાઈમર સિક્વન્સ કોષ્ટક 1 માં સૂચિબદ્ધ છે અને કાંગમેટ બાયોટેકનોલોજી કંપની લિમિટેડ (ચાંગચુન, ચીન) દ્વારા સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા.
Pfu DNA પોલિમરેઝ (Tiangen, Beijing, China) અથવા Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) નો ટેમ્પલેટ તરીકે તૈયાર G. duodenalis cDNA નો ઉપયોગ કરીને લક્ષ્યોને વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા.યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ વેક્ટર પ્લાઝમિડ pcDNA3.1(+) ને પ્રતિબંધ એન્ઝાઇમ EcoRV સાથે રેખિત કરવામાં આવ્યું હતું અને ફાસ્ટ એપી (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને ડિફોસ્ફોરીલેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું.લીનિયરાઇઝ્ડ pcDNA3.1(+) ટુકડાઓ અને એમ્પ્લીફાઇડ ટાર્ગેટ જનીન ટુકડાઓ ડીએનએ જેલ શુદ્ધિકરણ કીટ (ટિયનજેન) નો ઉપયોગ કરીને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા અને નેનોડ્રોપ ND-2000 (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને પરિમાણિત કરવામાં આવ્યા હતા.pcDNA3.1(+) ટુકડો અને દરેક લક્ષ્ય જનીન ટુકડાને MonClone સિંગલ એસેમ્બલી ક્લોનિંગ મિક્સ (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) નો ઉપયોગ કરીને ફરીથી જોડવામાં આવ્યા હતા અને Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) નો ઉપયોગ કરીને DNA સિક્વન્સિંગ દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી..
એન્ડોટોક્સિન-મુક્ત પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 અને pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-7.3 સેનપ્રેપ એન્ડોટોક્સિન-ફ્રી પ્લાઝમિડ મિની કિટ (સાંગોન બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવ્યા હતા.ઇલ્યુશન બફરમાં EDTA ટ્રાન્સફેક્શન પરીક્ષામાં દખલ ન કરે તેની ખાતરી કરવા માટે સાંદ્રતા 500 ng/µl ઉપર જાળવવામાં આવી હતી.પ્રાથમિક માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજને 12 કલાક માટે સંપૂર્ણ RPMI 1640 માધ્યમ (જૈવિક ઉદ્યોગો) સાથે 6-વેલ પ્લેટમાં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું, પછી પેનિસિલિન અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીનને દૂર કરવા માટે કોષોને ગરમ પીબીએસમાં 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, અને પછી માધ્યમમાં સંપૂર્ણ માધ્યમ સાથે પૂરક કરવામાં આવ્યા હતા.એન્ડોટોક્સિન-મુક્ત પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 અને pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-7.3 (2.5 μg) ઓપ્ટી-એમઈએમ ઘટાડેલા સીરમ માધ્યમ (જીબકો, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) ના 125 μl માં ભળે છે..પછી Lipofectamine 2000 ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ના 5 µl લો સીરમ Opti-MEM માધ્યમના 125 µl માં પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું.લિપોફેક્ટમાઇન 2000 સાથે પાતળું એન્ડોટોક્સિન-મુક્ત પ્લાઝમિડનું મિશ્રણ કરીને અને મિશ્રણને ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ સુધી ઊભા રહેવાની મંજૂરી આપીને લિપોસોમ-ડીએનએ સંકુલ તૈયાર કરો.કોમ્પ્લેક્સને દરેક કૂવામાં અલગથી કોષોમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને ધીમે ધીમે ભળી દો.4 કલાક પછી, સેલ કલ્ચર માધ્યમને 2 મિલી સંપૂર્ણ RPMI 1640 માધ્યમથી બદલવામાં આવ્યું અને કલ્ચર 24 કલાક માટે ચાલુ રાખવામાં આવ્યું.કોષોમાં તાજા કોષ સંવર્ધન માધ્યમ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને એસે ડિઝાઇનના આધારે વિવિધ સમય બિંદુઓ માટે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.
સુપરનેટન્ટ્સ અને સેલ લિસેટ્સમાંથી પ્રોટીન નમૂનાઓ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા [25].pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, અને His-tag માટે મેમ્બ્રેન ટ્રાન્સફર પરિમાણો 200 mA/90 મિનિટ હતા.ઇન્ટરલ્યુકિન 1β (IL-1β; R&D સિસ્ટમ્સ, મિનેપોલિસ, મિનેસોટા, યુએસએ), કેસ્પેસ-1 (p20) (એડિપોજેન, સ્વિટ્ઝર્લૅન્ડ) અને NLRP3 (એડિપોજેન SA, એપિલિન્જેસ, સ્વિટ્ઝર્લૅન્ડ) અને 1:5000 માટે તેમના ટૅગને લક્ષ્યાંકિત કરે છે ( એમીલેટ વૈજ્ઞાનિક વુહાન, ચીન) અને β-એક્ટિન (પ્રોટીનટેક, વુહાન, ચીન).
અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે ડિસ્કિનિમાઈડ સબરેટ (DSS) સાથે ક્રોસ-લિંકિંગ કરવામાં આવ્યું હતું [26].કોષોને ઠંડા પીબીએસથી 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને 25 એમએમ Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES અને 125 mM NaHCO3 ધરાવતા 50 μl ASC પ્રતિક્રિયા બફર (pH 8.0) માં 27 ગેજની સોય વડે સંપૂર્ણપણે લસવામાં આવ્યા હતા.મિશ્રણને 3 મિનિટ માટે 5000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને પેલેટને 10 µl DSS (DMSO માં 25 mM) અને 40 µl ASC પ્રતિક્રિયા બફર સાથે 30 મિનિટ માટે 37 ° સે પર સીવવામાં આવ્યું હતું.10 મિનિટ માટે 5000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કર્યા પછી, પેલેટને ASC પ્રતિક્રિયા બફરના 40 µl અને 6x પ્રોટીન લોડિંગ બફરના 10 µl (ટ્રાન્સજેન, બેઇજિંગ, ચીન) ના દ્રાવણમાં ઓગળવામાં આવ્યું હતું અને પછી દ્રાવણને ઓરડાના તાપમાને 15 માટે ઓગાળવામાં આવ્યું હતું. મિનિટ, પછી 10 મિનિટ ઉકાળો.પ્રોટીનના નમૂનાઓ પછી 1:500 ના મંદન ગુણોત્તરમાં પ્રાથમિક એન્ટિ-એએસસી એન્ટિબોડીઝ (વાનલીબીઓ, શેન્યાંગ, ચીન) નો ઉપયોગ કરીને પશ્ચિમી બ્લોટિંગને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા.
અગાઉ વર્ણવેલ પ્રક્રિયા [13]ને અનુસરીને, સેલ કલ્ચર સુપરનેટન્ટ્સનો પાક લેવામાં આવ્યો હતો અને માઉસ IL-1 બીટા ELISA કીટ (ઇન્વિટ્રોજન, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને પ્રો-ઇન્ફ્લેમેટરી સાઇટોકિન IL-1β સ્ત્રાવ નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો.IL-1β પ્રમાણભૂત વળાંકનો ઉપયોગ કરીને OD450nm મૂલ્યોને પ્રોટીન સાંદ્રતામાં કન્વર્ટ કરો.
કવરસ્લિપ્સ પર કોટેડ કોષોને ગરમ પીબીએસમાં 3 વખત હળવા હાથે ધોવામાં આવ્યા હતા, ટીશ્યુ સેલ ફિક્સેટિવ (બાયોશાર્પ, બેઇજિંગ, ચાઇના) માં 10 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને (આરટી), 0.1% ટ્રાઇટોન એક્સ-પર્મેબિલાઈઝમાં 100 પર ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા (પીબીએસમાં પાતળું; બાયોશાર્પ ) ઓરડાના તાપમાને 20 મિનિટ માટે અને 5% બોવાઇન સીરમ આલ્બ્યુમિન (PBS માં) ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક માટે બ્લોક કરો.ત્યારબાદ કોષોને અનુક્રમે ASC (1:100 મંદન) અથવા NLRP3 (1:100 મંદન) સામે પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ સાથે 4°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, અને Cy3 બકરી વિરોધી સસલા IgG(H+L) (1:400; અર્થઓક્સ) લેબલવાળા હતા. , સાન ફ્રાન્સિસ્કો, CA, USA) અથવા FITC-સંયુક્ત બકરી વિરોધી માઉસ IgG (1:400; અર્થોક્સ) રાતોરાત 37°C પર 1 કલાક માટે અંધારામાં.ન્યુક્લી પર 5 મિનિટ માટે Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) થી ડાઘ લગાવવામાં આવ્યા હતા અને ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપ (ઓલિમ્પસ કોર્પોરેશન, ટોક્યો, જાપાન) હેઠળ અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉંદરને ચાર જૂથોમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા (દરેક જૂથમાં n = 7): (i) PBS-સારવાર થયેલ નકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ (ફક્ત PBS; ગેવેજ 100 µl/માઉસ PBS ત્યારબાદ દૈનિક ઈન્ટ્રાપેરીટોનિયલ ઈન્જેક્શન 100 µl/માઉસ PBS 3 કલાક પછી)., સતત 7 દિવસ માટે);(ii) નકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ MCC950 અવરોધક [27] (PBS ગેવેજ દ્વારા 100 µl/માઉસ, 3 કલાક પછી, 10 mg/kg શરીરનું વજન [BW] MCC950 [PBS માં] ઇન્ટ્રાપેરીટોનલી દરરોજ સંચાલિત કરવામાં આવ્યું હતું, સમયગાળો 7 દિવસ);(iii) જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ ઇન્ફેક્શન ગ્રૂપ (1.5 x 106 સિસ્ટ્સ/માઉસ ગેવેજ દ્વારા, 3 કલાક પછી, 100 μl/માઉસ PBS ઇન્ટ્રાપેરીટોનલી 7 દિવસ માટે દરરોજ સંચાલિત);(iv) જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ સંયુક્ત ચેપ જૂથ MCC950 અવરોધક સારવાર જૂથ (1.5×106 કોથળીઓ/માઉસ વાયા ગેવેજ, 10mg/kg શરીરનું વજન MCC950 intraperitoneally 7 દિવસ માટે દરરોજ 3h).દરેક ઉંદરના શરીરના વજનનું દરરોજ નિરીક્ષણ કરવામાં આવતું હતું અને 7મા દિવસે તમામ ઉંદરોને ઇથનાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા.લણણી કરાયેલ ડ્યુઓડેનમ (3 સે.મી. લાંબું) 1 મિલી પીબીએસમાં નાના ટુકડાઓમાં કાપવામાં આવ્યું હતું, પીબીએસમાં 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર કોથળીઓ રાતોરાત નાશ પામી હતી અને જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ટ્રોફોઝોઈટ્સ.તાજા ડ્યુઓડેનમ (1 સે.મી. લાંબું) હેમેટોક્સિલિન અને ઇઓસિન (H&E) સ્ટેનિંગ માટે અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉંદરને બે જૂથોમાં વહેંચવામાં આવ્યા હતા: (i) MOCK નિયંત્રણ જૂથ અને (ii) MCC950 અવરોધક જૂથ.દરેક જૂથમાં પાંચ સારવાર હતી (n = 7/સારવાર જૂથ): (i) PBS સારવાર નકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ (ફક્ત PBS; 100 μl/માઉસ PBS, ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર (IM) ઇન્જેક્શન (ટિબિઆલિસ અગ્રવર્તી) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) પ્લાઝમિડ નેગેટિવ કંટ્રોલ ગ્રૂપ (100 µg/માઉસ ડીએનએ, ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શન દ્વારા); પ્લાઝમિડ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 (100 μg/માઉસ ડીએનએ, ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શન દ્વારા) અને (v) પ્લાઝમિડ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-7.3 (100 μg/માઉસ) સાથે સારવાર કરાયેલ જૂથ DNA, 12 કલાક પસાર થયા પછી, MCC950 અવરોધક જૂથના ઉંદરોને 7 દિવસ માટે MCC950 (10 mg/kg શરીરનું વજન) નું દૈનિક ઇન્ટ્રાપેરીટોનિયલ ઇન્જેક્શન મળ્યું, જ્યારે MOCK જૂથના ઉંદરોએ PBS સારવારની સમાન માત્રા પ્રાપ્ત કરી. લોહીના નમૂના લેવામાં આવ્યા. IL-1β સ્તરો અને માપન માટે એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA) નો ઉપયોગ કરીને આંખની કીકીના ઉંદરોમાંથી એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને 4 °C પર રાતોરાત છોડી દેવામાં આવ્યા.
પાંત્રીસ ઉંદરોને પાંચ જૂથોમાં વહેંચવામાં આવ્યા હતા (n=7/જૂથ).જૂથ 1 એ પીબીએસ સાથે સારવાર કરાયેલ નકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ હતું: ઉંદરને 100 μl પીબીએસ ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલરલી અને 3 દિવસ પછી ગેવેજ દ્વારા પ્રાપ્ત થયું.ગ્રુપ 2 એ જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ્સથી ચેપગ્રસ્ત હકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ છે: ઉંદરને 100 μl પીબીએસ સાથે ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને 3 દિવસ પછી 1.5 x 106 સિસ્ટ્સ/માઉસને ઇન્ટ્રાગેસ્ટ્રિકલી ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.ત્રીજું જૂથ - ડ્યુઓડીનલ સિસ્ટ ચેપ માટે નિયંત્રણ જૂથ સાથે સંયોજનમાં pcDNA3.1(+) સાથે પ્લાઝમિડ ઇમ્યુનાઇઝેશન: ઉંદરને 100 μg પ્લાઝમિડ DNA pcDNA3.1(+)(im) મૌખિક રીતે, 1.5×106 કોથળીઓ/માઉસ 3 મળ્યા દિવસ.જૂથ 4 અને 5 જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ ઇન્ફેક્શન સાથે સંયોજનમાં રિકોમ્બિનન્ટ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid અથવા pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine પ્લાઝમિડ હતા.પ્રાયોગિક જૂથ: ઉંદરને 100 µg pcDNA3 પ્રાપ્ત થયું.1(+)-ગિઆર્ડિન પ્લાઝમિડ DNA (im), પછી 3 દિવસ પછી, 1.5 × 106 સિસ્ટ્સ/માઉસને ગેવેજ દ્વારા ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.ટ્યુબ દ્વારા જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટની રજૂઆત પછી દરેક ઉંદરના શરીરના વજનનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.તાજા ડ્યુઓડેનમ પરોપજીવી લોડ માપન અને HE સ્ટેનિંગ વિશ્લેષણ માટે એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.
અગાઉ પ્રકાશિત પ્રક્રિયા [30] અનુસાર હિસ્ટોપેથોલોજીકલ ફેરફારોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.તાજા ડ્યુઓડેનમને ટીશ્યુ સેલ ફિક્સેટિવ સાથે ઠીક કરવામાં આવ્યું હતું, પેરાફિનમાં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યું હતું, 4 μm વિભાગોમાં કાપવામાં આવ્યું હતું, H&E સાથે સ્ટેન કરવામાં આવ્યું હતું અને હળવા માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.સાત સ્વતંત્ર ઉંદરોના સાત પેશી વિભાગોમાં પ્રતિનિધિત્વાત્મક પેથોલોજીકલ ફેરફારોનું મૂલ્યાંકન પેથોલોજિસ્ટ દ્વારા સારવારથી અજાણ હતું અને 200x વિસ્તૃતીકરણ પર કેપ્ચર કરવામાં આવ્યું હતું.વિલીની લંબાઈ અને ક્રિપ્ટ્સની ઊંડાઈ અગાઉ વર્ણવેલ પદ્ધતિઓ અનુસાર માપવામાં આવી હતી.
વિટ્રો અને વિવોમાં પરિણામો ત્રિપુટીમાં પ્રાપ્ત થયા હતા.GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) નો ઉપયોગ કરીને ગ્રાફ જનરેટ કરવામાં આવ્યા હતા.બે જૂથો વચ્ચેના તફાવતોનું ટી-ટેસ્ટ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે ≥3 જૂથો વચ્ચેના તફાવતોનું વિશ્લેષણ SPSS સોફ્ટવેર (સંસ્કરણ 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) નો ઉપયોગ કરીને એક-માર્ગીય વિશ્લેષણ (ANOVA) દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું.લેવેન ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને વિભિન્નતાની એકરૂપતા માટે ડેટાનું પૃથ્થકરણ કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ બોનફેરોનીની પોસ્ટ હોક ટેસ્ટ (B) દ્વારા કરવામાં આવી હતી.મહત્વ P<0.05, P<0.01, અને P<0.001 (નોંધપાત્ર નથી [ns]) (P>0.05) તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે.
ક્યોટો એનસાયક્લોપીડિયા ઓફ જીન્સ એન્ડ જીનોમ્સ (KEGG) માં GEV પ્રોટીઓમિક્સના અમારા અગાઉના વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ઘણા લક્ષ્યો બળતરા સિગ્નલિંગ પાથવેના સક્રિયકરણમાં સામેલ હોઈ શકે છે [13].અમે બે આશાસ્પદ લક્ષ્યો પસંદ કર્યા છે, આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન્સ, આ પરમાણુઓને વિસ્તૃત કરો અને pcDNA3.1(+) યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ વેક્ટર બનાવવા માટે તેનો ઉપયોગ કરો.સિક્વન્સિંગ પછી, રિકોમ્બિનન્ટ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન એક્સપ્રેશન પ્લાઝમિડ્સ પ્રાથમિક માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજેસમાં રૂપાંતરિત થયા હતા, અને બળતરાના કેસ્પેસ-1 p20 સિગ્નેચર પ્રોટીન (સક્રિય કેસ્પેઝ-1નો ટુકડો) ઓળખવામાં આવ્યો હતો. મુખ્ય અણુઓને સ્પષ્ટ કરવા જે બળતરાને ઉત્તેજિત કરી શકે છે.પરિણામો દર્શાવે છે કે આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન P20 કેસ્પેસ-1 અભિવ્યક્તિને GEV જેવી જ પ્રેરિત કરી શકે છે.સારવાર ન કરાયેલ નેગેટિવ કંટ્રોલ (ફક્ત પીબીએસ) અને પ્લાઝમિડ કંટ્રોલ pcDNA3.1(+) (આકૃતિ 1) માં કેસ્પેસ-1 સક્રિયકરણ પર કોઈ અસર જોવા મળી નથી.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 અને alpha-7.3 giardins દ્વારા p20 caspase-1 સક્રિયકરણનું માપન.રિકોમ્બિનન્ટ યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન (દરેક ગલીની ઉપર) પ્રાથમિક માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને કલ્ચર સુપરનેટન્ટ્સ 24 કલાક પછી કાપવામાં આવ્યા હતા.વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગનો ઉપયોગ સિગ્નેચર કેસ્પેસ-1 p20 ઇન્ફ્લેમસોમ પ્રોટીનના અભિવ્યક્તિ સ્તરને માપવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.PBS-માત્ર સારવાર જૂથ (લેન C) અને pcDNA3.1(+) મોનોથેરાપી જૂથ (pcDNA3.1 લેન) નો ઉપયોગ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો, અને GEV સારવાર જૂથનો ઉપયોગ હકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ દરેક પ્રોટીનમાં હિસ્ટિડિન ટેગ શોધીને કરવામાં આવી હતી, અને અપેક્ષિત પ્રોટીન બેન્ડ આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન (38.2 kDa) અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન (37.2 kDa) હતા.GEV, ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર વેસિકલ્સ, pcDNA3.1(+), EcoRV-રેખીય વેક્ટર, SUP, સુપરનેટન્ટ
આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન p20 કેસ્પેસ-1 અભિવ્યક્તિને પ્રેરિત કરે છે અને યજમાન NLRP3 બળતરા પ્રતિભાવ, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine અને pcDNA3.1(+)-આલ્ફા સક્રિય કરવામાં ભૂમિકા ભજવે છે તે નિર્ધારિત કરવા. -7.3 ગિઆર્ડિનને રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝમિડ ડીએનએ સાથે પ્રાથમિક માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજેસમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું, અને કી બળતરા પ્રોટીન NLRP3 ના અભિવ્યક્તિ, સ્થાનિકીકરણ અને ઓલિગોમેરાઇઝેશનનું સ્તર નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.આ પ્રયોગમાં, GEV નો ઉપયોગ સકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો, અને કોઈ સારવાર જૂથ (ફક્ત PBS) અથવા pcDNA3.1(+) ટ્રાન્સફેક્શન સારવાર જૂથ નકારાત્મક જૂથ હતું.પરિણામો દર્શાવે છે કે, GEV જૂથની જેમ, giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 અને giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ના રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝમિડ ડીએનએના પરિણામે NLRP3, પ્રો-IL-1β અને procaspase-1 અને caspase-1 સક્રિયકરણ (ફિગ. 2a).વધુમાં, બંને ગિઆર્ડીન નોંધપાત્ર IL-1β સ્ત્રાવને પ્રેરિત કરે છે (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.007 ).;આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (આકૃતિ 2b).મોટાભાગના ASC પ્રોટીન નો-ટ્રીટમેન્ટ ગ્રૂપમાં અથવા pcDNA3.1(+) પ્લાઝમિડથી ટ્રાન્સફેક્ટ થયેલા સારવાર જૂથમાં મોનોમેરિક હતા, pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 અથવા pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-થી વિપરીત. 7.3 જિયાર્ડિન.ASC ઓલિગોમેરાઇઝેશન GEV હકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ અથવા જૂથના રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝમિડ ડીએનએમાં થયું છે, જે ઓલિગોમેરિક સ્વરૂપ (આકૃતિ 2c) દર્શાવે છે.આ પ્રારંભિક ડેટા સૂચવે છે કે આલ્ફા-2 જિયાર્ડિન અને આલ્ફા-7,3 ગિઆર્ડિન NLRP3 બળતરા સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરી શકે છે.ASC અને NLRP3 ના સ્થાનિકીકરણના અનુગામી ઇમ્યુનોફ્લોરોસન્ટ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે નકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથમાં, ASC પ્રોટીન સમગ્ર સાયટોપ્લાઝમમાં ફેલાયેલું હતું અને giardine અથવા pcDNA3 સાથે pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 ની ઉત્તેજના પર ડોટ સિગ્નલ તરીકે દેખાય છે.1(+)-આલ્ફા-7,3 ગિઆર્ડિન જૂથ અથવા GEV હકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ (આકૃતિ 2d).નેગેટિવ કંટ્રોલ અને પ્લાઝમિડ-ટ્રીટેડ pcDNA 3.1 જૂથોમાં, NLRP3 પ્રોટીન સિગ્નલ શોધાયું ન હતું, જ્યારે pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અથવા pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-7.3 ના પ્રતિભાવમાં ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ ડોટ. શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું..ગિઆર્ડિન સાયટોપ્લાઝમમાં અથવા HEV (ફિગ. 2e) ની ઉત્તેજના પર જોવા મળે છે.આ ડેટા આગળ દર્શાવે છે કે G. duodenalis giardin alpha-2 અને giardin alpha-7.3 માઉસના પ્રાથમિક પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજમાં NLRP3 બળતરાને સક્રિય કરે છે.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin અને pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજમાં NLRP3 બળતરાને સક્રિય કરે છે.રિકોમ્બિનન્ટ યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin અને pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ને પ્રાથમિક મ્યુરિન પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજ અને કોષોમાં સ્થાનાંતરિત કરો, અથવા અભિવ્યક્તિ, ઓલિગોમરાઇઝેશનના વિશ્લેષણ માટે 24 કલાકની અંદર સુપરનેટન્ટની લણણી કરો. , સ્ત્રાવ.અને મુખ્ય બળતરા પ્રોટીનનું સ્થાનિકીકરણ.PBS-માત્ર (C) જૂથ અને pcDNA3.1(+) સિંગલ ટ્રીટમેન્ટ ગ્રૂપનો નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને GEV સારવાર જૂથનો ઉપયોગ હકારાત્મક જૂથ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.NLRP3, પ્રો-IL-1β, પ્રો-કેસ્પેસ-1 અને p20 કેસ્પેસ-1 સહિત મુખ્ય બળતરા પ્રોટીન NLRP3, પશ્ચિમી બ્લોટિંગ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા.b સુપરનેટન્ટ્સમાં IL-1β ના સ્ત્રાવનું સ્તર એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.SPSS સોફ્ટવેર વર્ઝન 22.0 નો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રણ અને પ્રાયોગિક જૂથો વચ્ચેના તફાવતોનું એક-માર્ગીય વિશ્લેષણ (ANOVA) દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી **P<0.01 અને ***P<0.001 જૂથો વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે.c ગોળીઓમાં ASC ઓલિગોમેરાઇઝેશન સ્તર DSS ક્રોસ-લિંકિંગ વિશ્લેષણ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે સેલ લિસેટ્સમાં ASC સ્તરો લોડિંગ નિયંત્રણ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાતા હતા.d ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સનો ઉપયોગ કરીને ISC સ્થાનિકીકરણનું વિઝ્યુલાઇઝેશન.e ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સનો ઉપયોગ NLRP3 ના સ્થાનિકીકરણની કલ્પના કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.ASC, એપોપ્ટોટિક સ્પેક-જેવા પ્રોટીન;IL, interleukin;NLRP3, ન્યુક્લિયોટાઇડ-બંધનકર્તા ઓલિગોમેરાઇઝેશન-જેવા રીસેપ્ટર 3;ns, નોંધપાત્ર નથી (P > 0.05)
G. ડ્યુઓડેનાલિસ અને GEV જે તે સ્ત્રાવ કરે છે તે બંને NLRP3 બળતરાને સક્રિય કરે છે અને વિટ્રોમાં યજમાન દાહક પ્રતિક્રિયાઓનું નિયમન કરે છે.આમ, જી. ડ્યુઓડેનાલિસના રોગકારકતામાં NLRP3 બળતરાની ભૂમિકા અસ્પષ્ટ રહે છે.આ મુદ્દાની તપાસ કરવા માટે, અમે G. duodenalis cyst થી સંક્રમિત ઉંદર અને G. duodenalis cyst + MCC950 ઇન્હિબિટર ટ્રીટમેન્ટથી સંક્રમિત ઉંદર વચ્ચે એક પ્રયોગ ડિઝાઇન કર્યો અને જ્યારે G. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટથી ચેપ લાગ્યો ત્યારે NLRP3 દાહક અભિવ્યક્તિની સરખામણી કરી.પ્રયોગની વિગતવાર યોજના ફિગ. 3a માં બતાવવામાં આવી છે.વિવિધ સારવાર જૂથોમાં ઉંદરના શરીરના વજનમાં થતા ફેરફારોને કોથળીઓના ચેપ પછી 7 દિવસ સુધી મોનિટર કરવામાં આવ્યું હતું, અને પરિણામો ફિગ. 3b માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.શુદ્ધ પીબીએસ સાથે સારવાર કરાયેલા જૂથની સરખામણીમાં, પરિણામો દર્શાવે છે કે (i) જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટથી સંક્રમિત ઉંદરના શરીરના વજનમાં ચેપ પછી 3 દિવસથી 7 દિવસ સુધી ઘટાડો થયો છે;(ii) MCC950 અવરોધક સાથેની સારવારની ઉંદરના શરીરના વજન પર કોઈ નોંધપાત્ર અસર થઈ નથી..એકલ ચેપ જૂથની તુલનામાં, MCC950 સાથે સારવાર કરાયેલ ડ્યુઓડીનલ ચેપ જૂથનું BW વિવિધ ડિગ્રી (દિવસ 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; દિવસ 2: ANOVA, F( 3, 24) સુધી ઘટ્યું. ) = 0.4602, P<0.0001; દિવસ 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; દિવસ 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052, ANOVA; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; દિવસ 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; દિવસ 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).આ ડેટા દર્શાવે છે કે NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ ઉંદરને ડ્યુઓડીનલ ચેપના પ્રારંભિક તબક્કામાં (2-4 દિવસ) નોંધપાત્ર વજન ઘટાડવાથી રક્ષણ આપે છે.પછી અમે ડ્યુઓડીનલ લેવેજ પ્રવાહીમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ટ્રોફોઝોઇટ્સ શોધવાનું લક્ષ્ય રાખ્યું અને પરિણામો આકૃતિ 3c માં દર્શાવ્યા છે.જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ ઇન્ફેક્શન ગ્રૂપની સરખામણીમાં, NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ (t(12) = 2.902, P = 0.0133) અવરોધિત કર્યા પછી ડ્યુઓડેનમમાં ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યામાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે.એકલા પીબીએસ અને એમસીસી 950 સાથે સારવાર કરાયેલ નકારાત્મક નિયંત્રણની તુલનામાં HE સાથે ડાઘવાળા ડ્યુઓડીનલ પેશીઓ દર્શાવે છે: (i) જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ ચેપના પરિણામે ડ્યુઓડેનલ વિલી (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ને નુકસાન થયું હતું. ) અને ક્રિપ્ટ એટ્રોફી (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ્સથી સંક્રમિત ઉંદરમાંથી ડ્યુઓડેનમ અને MCC950 અવરોધકો સાથે સારવાર.ડ્યુઓડીનલ વિલી ક્ષતિગ્રસ્ત અને મૃત (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) એટ્રોફી અને ક્રિપ્ટ બ્રાન્ચિંગ સાથે (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (ફિગ. 3d- f).આ પરિણામો સૂચવે છે કે NLRP3 બળતરા G. ડ્યુઓડેનાલિસની રોગકારકતાને ઘટાડવામાં ભૂમિકા ભજવે છે.
ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ ચેપમાં NLRP3 બળતરાની ભૂમિકા.ઉંદરને ડ્યુઓડેનોકોકલ કોથળીઓ સાથે ગેવેજ કરવામાં આવ્યા હતા (iv) અને પછી MCC950 (ip) સાથે અથવા વગર સારવાર કરવામાં આવી હતી.PBS અથવા MCC950 સાથે એકલ સારવાર જૂથોનો ઉપયોગ નિયંત્રણો તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રાયોગિક જૂથ અને સારવાર પદ્ધતિ.b દરેક વિવિધ સારવાર જૂથોમાં ઉંદરના શરીરના વજનનું 7 દિવસ સુધી નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.G. duodenalis ચેપ જૂથ અને G. duodenalis + MCC950 ચેપ સારવાર જૂથ વચ્ચેના તફાવતનું SPSS સોફ્ટવેર સંસ્કરણ 22.0 નો ઉપયોગ કરીને ટી-ટેસ્ટ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી *P<0.05, **P<0.01, અથવા ***P<0.001 પર નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે.c ડ્યુઓડીનલ લેવેજ પ્રવાહીમાં ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યાની ગણતરી કરીને પરોપજીવી ભાર નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો.G. duodenalis ચેપ જૂથ અને G. duodenalis + MCC950 ચેપ સારવાર જૂથ વચ્ચેના તફાવતનું SPSS સોફ્ટવેર સંસ્કરણ 22.0 નો ઉપયોગ કરીને ટી-ટેસ્ટ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી *P <0.05 પર નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.d હેમેટોક્સિલિન અને ઇઓસિન (H&E) ડ્યુઓડીનલ હિસ્ટોપેથોલોજીના સ્ટેનિંગ પરિણામો.લાલ તીર વિલીને નુકસાન સૂચવે છે, લીલા તીર ક્રિપ્ટ્સને નુકસાન સૂચવે છે.સ્કેલ બાર: 100 µm.e, f ડ્યુઓડીનલ વિલસની ઊંચાઈ અને માઉસ ક્રિપ્ટની ઊંચાઈનું આંકડાકીય વિશ્લેષણ.ફૂદડી *P<0.05 અને **P<0.01 પર નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.પરિણામો 7 સ્વતંત્ર જૈવિક પ્રયોગોમાંથી લેવામાં આવ્યા છે.BW, શરીરનું વજન;ig, ઇન્ટ્રાગેસ્ટ્રિક ડિલિવરી રૂટ;ip, ઇન્ટ્રાપેરીટોનિયલ ડિલિવરી રૂટ;ns, નોંધપાત્ર નથી (P > 0.05);પીબીએસ, ફોસ્ફેટ બફર ખારા;WT, જંગલી પ્રકાર
IL-1β નું સ્ત્રાવ એ બળતરા સક્રિયકરણની ઓળખ છે.G. duodenalis alpha-2 giardine અને alpha-7.3 giardine Vivoમાં NLRP3 હોસ્ટ ઇન્ફ્લેમાસોમને સક્રિય કરે છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે, અમે સારવાર ન કરાયેલ WT ઉંદર (શેમ જૂથ) અને NLRP3 ઇન્ફ્લેમસોમ-બ્લોક્ડ ઉંદર (MCC950 ઇન્હિબિટેડ ટ્રીટમેન્ટ ગ્રૂપ) નો ઉપયોગ કર્યો.પ્રયોગની વિગતવાર યોજના ફિગ. 4a માં બતાવવામાં આવી છે.પ્રાયોગિક જૂથોમાં PBS, G. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ ટ્રીટમેન્ટ દ્વારા ગેવેજ, pcDNA3.1 ના ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શન અને pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અથવા pcDNA3.1-આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિનના ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શનનો સમાવેશ થતો હતો.રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝમિડના ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર એડમિનિસ્ટ્રેશન પછી 7 મા દિવસે, સીરમ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને દરેક જૂથમાં IL-1β નું સ્તર નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.આકૃતિ 4b માં બતાવ્યા પ્રમાણે, MOCK જૂથમાં: (i) PBS જૂથની તુલનામાં, pcDNA3.1 સારવારની IL-1β સ્ત્રાવ (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998) પર કોઈ નોંધપાત્ર અસર થઈ નથી, જોકે, IL-β સ્ત્રાવ G. duodenalis cyst group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine અને pcDNA3 માં નોંધપાત્ર રીતે વધ્યો હતો.1- આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિનના ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શને સીરમ IL-1β સ્તરમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine pcDNA3.1-alpha-2 giardine ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શન જૂથ (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) માં IL-1β સ્ત્રાવના ઉચ્ચ સ્તરને પ્રેરિત કરે છે. .MCC950 ટ્રીટમેન્ટ ગ્રૂપ અને MOCK ગ્રૂપમાં દરેક જૂથની સરખામણીમાં: (i) PBS કંટ્રોલ ગ્રૂપ અને pcDNA3.1 કંટ્રોલ ગ્રૂપમાં IL-1β સ્ત્રાવનું સ્તર MCC950 અવરોધકને અવરોધિત કર્યા પછી અમુક હદ સુધી ઘટ્યું હતું, પરંતુ તફાવત ન હતો. નોંધપાત્ર (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 ને અવરોધિત કર્યા પછી., IL-1β સ્ત્રાવ G. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ-સંક્રમિત જૂથ, pcDNA3.1-આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન જૂથ, અને pcDNA3.1-આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન જૂથ (G. duodenalis: ANOVA, F(9) માં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો. . ) = 3.540, P = 0.0164).આ પરિણામો સૂચવે છે કે આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 જિયાર્ડિન વિવોમાં એનએલઆરપી3 ઇન્ફ્લેમસોમના સક્રિયકરણમાં મધ્યસ્થી કરે છે.
pcDNA3.1(+)-ગિઆર્ડિન વિવોમાં NLRP3 હોસ્ટ ઇન્ફ્લેમાસોમને સક્રિય કરે છે.ઉંદરને રિકોમ્બિનન્ટ યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine અથવા pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine સાથે ઇમ્યુનાઇઝ્ડ (IM) કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી MCC950 (ip; MCC950 જૂથ) સાથે સારવાર કરવામાં આવી હતી કે નહીં (ડમી જૂથ) ).PBS અથવા pcDNA3.1(+) પ્લાઝમિડ સારવાર જૂથનો ઉપયોગ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો, G. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટ સારવાર જૂથનો ઉપયોગ હકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રાયોગિક જૂથ અને સારવાર પદ્ધતિ.b ઉંદરમાં IL-1β નું સીરમ સ્તર ELISA પરીક્ષા દ્વારા 7મા દિવસે માપવામાં આવ્યું હતું.MOCK જૂથમાં જૂથો વચ્ચેના તફાવતોનું વિશ્લેષણ વન-વે ANOVA નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું, અને SPSS સોફ્ટવેર સંસ્કરણ 22.0 ના ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને MOCK જૂથ અને MCC950 જૂથ વચ્ચેના તફાવતોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી MOCK જૂથમાં સારવાર જૂથો વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે, *P<0.05 અને ***P<0.001;ડૉલર ચિહ્નો ($) MOCK જૂથના દરેક જૂથ અને P<0.05 પર MCC950 જૂથ વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે.સાત સ્વતંત્ર જૈવિક પ્રયોગોના પરિણામો.i, ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શન, ns, નોંધપાત્ર નથી (P > 0.05)
G. duodenalis infectivity પર NLRP3 હોસ્ટ ઇન્ફ્લેમાસોમના આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 જિયાર્ડિન-મધ્યસ્થી સક્રિયકરણની અસરની તપાસ કરવા માટે, અમે WT C57BL/6 ઉંદરનો ઉપયોગ કર્યો અને આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન ઇન્જેક્ટ કર્યા.જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટની ગેસ્ટ્રિક ટ્યુબ દ્વારા 3 દિવસ પછી, પ્લાઝમિડને ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર રીતે ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ ઉંદરને 7 દિવસ સુધી જોવામાં આવ્યા હતા.પ્રયોગની વિગતવાર યોજના ફિગ. 5a માં બતાવવામાં આવી છે.દરેક માઉસનું શરીરનું વજન દરરોજ માપવામાં આવતું હતું, ગેસ્ટ્રિક ટ્યુબ દ્વારા વહીવટ પછી 7 મા દિવસે તાજા ડ્યુઓડેનલ પેશીઓના નમૂના લેવામાં આવ્યા હતા, ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યા માપવામાં આવી હતી અને હિસ્ટોપેથોલોજિકલ ફેરફારો જોવા મળ્યા હતા.આકૃતિ 5b માં બતાવ્યા પ્રમાણે, ખોરાક આપવાનો સમય વધવા સાથે, દરેક જૂથમાં ઉંદરનો BW ધીમે ધીમે વધતો ગયો.જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સિસ્ટના ઇન્ટ્રાગેસ્ટ્રિક એડમિનિસ્ટ્રેશન પછી 3 જી દિવસે ઉંદરનું MT ઘટવાનું શરૂ થયું, અને પછી ધીમે ધીમે વધ્યું.આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા7.3 ગિઆર્ડિનના ઇન્ટ્રામસ્ક્યુલર ઇન્જેક્શન દ્વારા પ્રેરિત NLRP3 ઇન્ફ્લેમસોમના સક્રિયકરણથી ઉંદરમાં વજનમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થાય છે (દિવસ 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.39 = 0 .9754 દિવસ 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 દિવસ 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; દિવસ 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 દિવસ 3 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, FNOVA( 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 દિવસ 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 દિવસ 4: pcDNA3.1-આલ્ફા-અર્ડ, NOVA , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, દિવસ 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, દિવસ 5: pcDNA3.1-alpha - 2 ગિઆર્ડિન, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 દિવસ 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 દિવસ 6: pcDNA - 0.0001 alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, દિવસ 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;દિવસ 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 દિવસ 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001).ડ્યુઓડેનમ (ફિગ. 5c) માં પરોપજીવી ભારનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.સારવાર ન કરાયેલ સકારાત્મક નિયંત્રણ અને ખાલી pcDNA3.1 વેક્ટર સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયેલ જૂથની તુલનામાં, α-2 ગિઆર્ડિન અને α-7,3 ગિઆર્ડિન (pcDNA3.1-આલ્ફા) સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયેલા જૂથોમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો. -2 જિયાર્ડિન : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).વધુમાં, જિયાર્ડિન આલ્ફા-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081) કરતાં ઉંદરમાં giardine alfa-7.3 વધુ રક્ષણાત્મક હતું.HE સ્ટેનિંગના પરિણામો ફિગમાં બતાવવામાં આવ્યા છે.5d–f.આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયેલા ઉંદરમાં ઓછા ડ્યુઓડેનલ પેશીઓના જખમ હતા, જે G. ડ્યુઓડેનાલિસ સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયેલા ઉંદરો અને ખાલી pcDNA3 વેક્ટર .1 Zoom સાથે સંયોજનમાં G. ડ્યુઓડેનાલિસ સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયેલ ઉંદરની તુલનામાં વિલસ નુકસાન દ્વારા પ્રગટ થાય છે.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 અથવા P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.46, P = 0.0028 અથવા P = 0.0055) અને ઘટાડો ક્રિપ્ટ એટ્રોફી (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 અથવા P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 અથવા P = 0.0191).આ પરિણામો સૂચવે છે કે આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7,3 ગિઆર્ડિન વિવોમાં એનએલઆરપી3 બળતરાને સક્રિય કરીને જી. ડ્યુઓડેનાલિસની ચેપને ઘટાડે છે.
જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપમાં pcDNA3.1(+)-ગિઆર્ડિન્સની ભૂમિકા.ઉંદરને રિકોમ્બિનન્ટ યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડ્સ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine અથવા pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine સાથે ઇમ્યુનાઇઝ્ડ (IM) કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી G. duodenalis cysts (ig) સાથે પડકારવામાં આવ્યા હતા.PBS જૂથ અને pcDNA3.1(+) + ડ્યુઓડીનલ સિસ્ટ ટ્રીટમેન્ટ ગ્રૂપનો ઉપયોગ નેગેટિવ કંટ્રોલ ગ્રુપ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો, અને ડ્યુઓડીનલ સિસ્ટ ટ્રીટમેન્ટ ગ્રૂપનો ઉપયોગ સકારાત્મક નિયંત્રણ જૂથ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રાયોગિક જૂથ અને સારવાર પદ્ધતિ.b વિવિધ સારવાર જૂથોમાંના દરેકમાં ઉંદરના MTનું 7 દિવસ પછી પડકાર પછીનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી G. duodenalis જૂથ અને pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન જૂથ, *P < 0.05, **P < 0.01, અને ***P < 0.001;ડૉલર ચિહ્ન ($) G. duodenalis ના દરેક જૂથ અને pcDNA3.1(+)-આલ્ફા-7.3 જાર્ડિન જૂથ, $$P<0.01 અને $$$P<0.001 વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.c પરોપજીવી ભાર ડ્યુઓડેનમ (3 સે.મી. લાંબો) માંથી 1 મિલી ડ્યુઓડીનલ લેવેજમાં ટ્રોફોઝોઈટ્સની સંખ્યાની ગણતરી કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો અને ડ્યુઓડેનમના સેમી દીઠ પરોપજીવીઓની સંખ્યા તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યો હતો.G. duodenalis ચેપ જૂથ, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine જૂથ અને pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine જૂથ વચ્ચેના તફાવતોનું વિશ્લેષણ SPSS સોફ્ટવેર સંસ્કરણ 22.0 નો ઉપયોગ કરીને વન-વે ANOVA દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી **P<0.01 અને ***P<0.001 પર નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.ડ્યુઓડેનમમાં હિસ્ટોપેથોલોજીકલ ફેરફારો.લાલ તીર વિલીને નુકસાન સૂચવે છે, લીલા તીર ક્રિપ્ટ્સને નુકસાન સૂચવે છે.સ્કેલ બાર: 100 µm.e, f માઉસ ડ્યુઓડેનલ વિલસ ઊંચાઈ (e) અને ક્રિપ્ટ ઊંચાઈ (f) નું આંકડાકીય વિશ્લેષણ.આકૃતિ 1d માં જૂથો વચ્ચેના તફાવતોનું SPSS સોફ્ટવેર વર્ઝન 22.0 નો ઉપયોગ કરીને વન-વે ANOVA દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.ફૂદડી *P<0.05 અને **P<0.01 પર નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.સાત સ્વતંત્ર જૈવિક પ્રયોગોના પરિણામો.ns, નોંધપાત્ર નથી (P > 0.05)
ગિઆર્ડિયા ડ્યુઓડેનમ એ મનુષ્યો અને અન્ય સસ્તન પ્રાણીઓના આંતરડાના પરોપજીવી છે જે ગિઆર્ડિઆસિસનું કારણ બને છે.2004માં, 6 વર્ષથી વધુ વ્યાપને કારણે તેને WHO ઉપેક્ષિત રોગોની પહેલમાં સામેલ કરવામાં આવ્યું હતું, ખાસ કરીને નીચી સામાજિક આર્થિક સ્થિતિ ધરાવતા સમુદાયોમાં [32].જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપ સામે રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવમાં જન્મજાત રોગપ્રતિકારક શક્તિ નિર્ણાયક ભૂમિકા ભજવે છે.માઉસ મેક્રોફેજીસ એક્સ્ટ્રાસેલ્યુલર ટ્રેપ્સ [33] મુક્ત કરીને જી. ડ્યુઓડેનાલિસને ઘેરી લે છે અને મારી નાખે છે.અમારા અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે G. duodenalis, એક બિન-આક્રમક બાહ્યકોષીય પરોપજીવી, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, અને NLRP3 દાહક સિગ્નલિંગ પાથવેને માઉસ મેક્રોફેજમાં યજમાન દાહક પ્રતિક્રિયાઓનું નિયમન કરવા સક્રિય કરે છે, અને GEV બહાર પાડવામાં આવેલ આ પ્રક્રિયાને વધારી શકે છે.13], 24].જો કે, GEV માં NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ-રેગ્યુલેટેડ ઇન્ફ્લેમેશનમાં સામેલ ચોક્કસ PAMPs અને ગિઆર્ડિઆસિસમાં NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમની ભૂમિકા સ્પષ્ટ કરવાનું બાકી છે.આ બે પ્રશ્નો પર પ્રકાશ પાડવા માટે, અમે આ અભ્યાસ હાથ ધર્યો છે.
NLRP3 બળતરા રોગપ્રતિકારક કોષોના સાયટોપ્લાઝમમાં સ્થિત છે અને યુરિક એસિડ સ્ફટિકો, ઝેર, બેક્ટેરિયા, વાયરસ અને પરોપજીવી જેવા વિવિધ કણો દ્વારા સક્રિય થઈ શકે છે.બેક્ટેરિયલ અભ્યાસમાં, ઝેરને કી PAMPs તરીકે ઓળખવામાં આવે છે જે બળતરા સેન્સરને સક્રિય કરે છે, જે બળતરા અને કોષ મૃત્યુ તરફ દોરી જાય છે [34].કેટલાક માળખાકીય રીતે વૈવિધ્યસભર ઝેર, જેમ કે સ્ટેફાયલોકોકસ ઓરિયસ [35] અને એસ્ચેરીચીયા કોલી [36]માંથી હેમોલિસિન, એન્ટરટોક્સિન (NHE) [37] માંથી હેમોલિસિન BL (HBL), NLRP3 બળતરાના સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરે છે.વાયરલ અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે SARS-COV-2 એન્વલપ (E) પ્રોટીન [38] અને ઝીકા વાયરસ NS5 પ્રોટીન [39] જેવા વાઈરુલેન્સ પ્રોટીન એ NLRP3 રીસેપ્ટર દ્વારા ઓળખવામાં આવેલ મહત્વપૂર્ણ PAMPs છે.પરોપજીવી અભ્યાસોમાં, ઘણા પરોપજીવીઓ યજમાન દાહક સક્રિયકરણ સાથે સંકળાયેલા હોવાનું નોંધવામાં આવ્યું છે, જેમ કે ટોક્સોપ્લાઝ્મા ગોન્ડી, ટ્રાઇકોમોનાસ યોનિનાલિસ [40], ટ્રાયપેનોસોમા ક્રુઝી [41] અને લીશમેનિયા [42].ટોક્સોપ્લાઝ્મા ગોંડીના વાઇરુલન્સ સાથે સંકળાયેલા ગાઢ ગ્રાન્યુલ પ્રોટીન GRA35, GRA42 અને GRA43, લેવિસ ઉંદર મેક્રોફેજ [43] માં પાયરોપ્ટોસિસના ઇન્ડક્શન માટે જરૂરી છે.વધુમાં, કેટલાક લીશમેનિયા અભ્યાસોએ NLRP3 બળતરામાં સામેલ વ્યક્તિગત પરમાણુઓ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું છે, જેમ કે પરોપજીવી પટલ લિપોફોસ્ફોગ્લાયકેન [44] અથવા ઝીંક મેટાલોપ્રોટીઝ [45].જનીનોના એનેક્સિન જેવા આલ્ફા-ગિઆર્ડિન પરિવારમાં, આલ્ફા-1 ગિઆર્ડિનને માઉસ મોડેલ [18] માં જી. ડ્યુઓડેનાલિસ સામે રક્ષણ પૂરું પાડતી સંભવિત રસી ઉમેદવાર તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યું છે.અમારા અભ્યાસમાં, અમે G. duodenalis virulence factors alpha-2 અને alpha-7,3 giardines પસંદ કર્યા, જે giardia માટે અનન્ય છે પરંતુ પ્રમાણમાં ઓછા અહેવાલ છે.આ બે લક્ષ્ય જનીનોને બળતરા સક્રિયકરણના વિશ્લેષણ માટે pcDNA3.1(+) યુકેરીયોટિક અભિવ્યક્તિ સિસ્ટમ વેક્ટરમાં ક્લોન કરવામાં આવ્યા હતા.
અમારા માઉસ મોડેલમાં, ક્લીવ્ડ કેસ્પેસ ટુકડાઓ બળતરા સક્રિયકરણના માર્કર તરીકે સેવા આપે છે.ઉત્તેજના પર, NLRP3 એએસસી સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, પ્રોકાસ્પેસીસની ભરતી કરે છે અને સક્રિય કેસપેસ ઉત્પન્ન કરે છે જે પ્રો-IL-1β અને પ્રો-IL-18 ને અનુક્રમે -18 માં પરિપક્વ IL-1β અને IL-18 માં ફાટી જાય છે.ઇન્ફ્લેમેટરી કેસ્પેસીસ (કેસ્પેસ -1, -4, -5 અને -11) એ સિસ્ટીન પ્રોટીઝનું સંરક્ષિત કુટુંબ છે જે જન્મજાત સંરક્ષણ માટે મહત્વપૂર્ણ છે અને બળતરા અને પ્રોગ્રામ કરેલ કોષ મૃત્યુમાં સામેલ છે [46].કેસ્પેસ-1 કેનોનિકલ ઇન્ફ્લેમાસોમ્સ [47] દ્વારા સક્રિય થાય છે, જ્યારે કેસ્પેસ-4, -5 અને -11 એટીપિકલ ઇન્ફ્લેમાસોમ્સ [48] ની રચના દરમિયાન ક્લીવ્ડ થાય છે.આ અભ્યાસમાં, અમે માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજેસનો એક મોડેલ તરીકે ઉપયોગ કર્યો અને જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપના અભ્યાસમાં યજમાન NLRP3 બળતરા સક્રિયકરણના માર્કર તરીકે p20 કેસ્પેસ-1 ક્લીવ્ડ કેસ્પેઝ-1 ની તપાસ કરી.પરિણામો દર્શાવે છે કે ઘણા આલ્ફા-ગિઆર્ડિન્સ બળતરાના લાક્ષણિક સક્રિયકરણ માટે જવાબદાર છે, જે બેક્ટેરિયા અને વાયરસમાં સામેલ કી વાઇર્યુલન્સ પરમાણુઓની શોધ સાથે સુસંગત છે.જો કે, અમારો અભ્યાસ માત્ર પ્રારંભિક સ્ક્રીન છે અને ત્યાં અન્ય અણુઓ છે જે બિન-શાસ્ત્રીય બળતરાને સક્રિય કરી શકે છે, કારણ કે અમારા અગાઉના અભ્યાસમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસ ચેપ [13] માં ક્લાસિકલ અને નોન-ક્લાસિકલ બંને પ્રકારના ઇન્ફ્લેમાસોમ જોવા મળ્યા હતા.જનરેટ થયેલ p20 caspase-1 NLRP3 બળતરા સાથે સંકળાયેલું છે કે કેમ તે વધુ નિર્ધારિત કરવા માટે, અમે કી પરમાણુ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ સ્તર અને ASC ઓલિગોમેરાઇઝેશન સ્તરો નક્કી કરવા માટે આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિનને માઉસ પેરીટોનિયલ મેક્રોફેજમાં સ્થાનાંતરિત કર્યા છે, જે પુષ્ટિ કરે છે કે બંને α-giardins સક્રિય થાય છે. દાહક NLRP3.અમારા પરિણામો મેનકો-પ્રાયખોડા એટ અલ. કરતા થોડા અલગ છે, જેમણે અહેવાલ આપ્યો છે કે જી. મ્યુરીસ અથવા ઇ. કોલી EPEC સ્ટ્રેન્સ સાથેના Caco-2 કોષોની ઉત્તેજના માત્ર NLRP3, ASC અને કેસ્પેસ-1, ની ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતામાં વધારો કરી શકે છે. જોકે નોંધપાત્ર રીતે નહીં, જ્યારે G. muris અને E. coli ના કોસ્ટિમ્યુલેશનથી ત્રણ પ્રોટીનનું સ્તર કેવી રીતે વધ્યું [49].આ વિસંગતતા ગિઆર્ડિયા પ્રજાતિઓ, કોષ રેખાઓ અને પ્રાથમિક કોષોની પસંદગીમાં તફાવતને કારણે હોઈ શકે છે.અમે 5-અઠવાડિયાની સ્ત્રી WT C57BL/6 ઉંદરમાં MCC950 નો ઉપયોગ કરીને વિવો એસેમાં પણ પ્રદર્શન કર્યું, જે G. duodenalis માટે વધુ સંવેદનશીલ છે.MCC950 એક શક્તિશાળી અને પસંદગીયુક્ત નાના પરમાણુ NLRP3 અવરોધક છે જે નેનોમોલર સાંદ્રતા પર કેનોનિકલ અને નોન-કેનોનિકલ NLRP3 સક્રિયકરણને અવરોધે છે.MCC950 NLRP3 સક્રિયકરણને અટકાવે છે પરંતુ AIM2, NLRC4, અને NLRP1 બળતરા માર્ગો અથવા TLR સિગ્નલિંગ પાથવેના સક્રિયકરણને અસર કરતું નથી [27].MCC950 NLRP3 સક્રિયકરણને અવરોધે છે પરંતુ NLRP3 ની શરૂઆત, K+ પ્રવાહ, Ca2+ પ્રવાહ અથવા NLRP3 અને ASC વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને અટકાવતું નથી;તેના બદલે, તે ASC ઓલિગોમેરાઇઝેશન [27] ને અવરોધિત કરીને NLRP3 બળતરા સક્રિયકરણને અટકાવે છે.તેથી, અમે ગિઆર્ડિન ઇન્જેક્શન પછી NLRP3 બળતરાની ભૂમિકા નક્કી કરવા માટે વિવો અભ્યાસમાં MCC950 નો ઉપયોગ કર્યો.સક્રિય કેસ્પેસ-1 p10 પ્રો-ઇન્ફ્લેમેટરી સાઇટોકીન્સ પ્રો-IL-1β અને પ્રો-IL-18 ને પરિપક્વ IL-1β અને IL-18 [50] માં કાપી નાખે છે.આ અભ્યાસમાં, MCC950 સાથે અથવા તેના વગર ગિઆર્ડિન-સારવાર કરાયેલ ઉંદરોમાં સીરમ IL-1β સ્તરોનો ઉપયોગ NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ સક્રિય થયો હતો કે કેમ તે સૂચક તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.અપેક્ષા મુજબ, MCC950 સારવાર સીરમ IL-1β સ્તરોમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કરે છે.આ ડેટા સ્પષ્ટપણે દર્શાવે છે કે G. duodenalis giardin alfa-2 અને giardin alfa-7.3 NLRP3 માઉસના બળતરાને સક્રિય કરવામાં સક્ષમ છે.
છેલ્લા એક દાયકામાં સંચિત નોંધપાત્ર ડેટા દર્શાવે છે કે IL-17A એ જી. મ્યુરીસ સામે રોગપ્રતિકારક શક્તિનું મુખ્ય નિયમનકાર છે, IL-17RA સિગ્નલિંગને પ્રેરિત કરે છે, એન્ટિમાઇક્રોબાયલ પેપ્ટાઇડ્સનું ઉત્પાદન કરે છે અને પૂરક સક્રિયકરણનું નિયમન કરે છે [51].જો કે, ગિઆર્ડિયા ચેપ યુવાન વયસ્કોમાં વધુ વાર જોવા મળે છે, અને એવું નોંધવામાં આવ્યું છે કે યુવાન ઉંદરોમાં ગિઆર્ડિયા ચેપ તેની રક્ષણાત્મક અસર [૫૨] લાગુ કરવા માટે IL-17A પ્રતિભાવને સક્રિય કરતું નથી, જે સંશોધકોને અન્ય ઇમ્યુનોમોડ્યુલેટરી ગિઆર્ડિયા શોધવા માટે પ્રેરિત કરે છે.હેલ્મિન્થ ચેપની પદ્ધતિઓ.તાજેતરના અભ્યાસના લેખકોએ અહેવાલ આપ્યો છે કે જી. મુરીસ ઇ. કોલી ઇપીઇસી દ્વારા એનએલઆરપી3 ઇન્ફ્લેમસોમને સક્રિય કરી શકે છે, જે એન્ટિમાઇક્રોબાયલ પેપ્ટાઇડ્સના ઉત્પાદનને પ્રોત્સાહન આપે છે અને તેની જોડાણ ક્ષમતા અને આંતરડાના માર્ગમાં ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યા ઘટાડે છે, જેનાથી કોલોનની તીવ્રતા ઓછી થાય છે. બેસિલીના કારણે થતા રોગો [49].NLRP3 બળતરા વિવિધ રોગોના વિકાસમાં સામેલ છે.અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે સ્યુડોમોનાસ એરુગિનોસા કોષના મૃત્યુને ટાળવા માટે મેક્રોફેજમાં ઓટોફેજીને ટ્રિગર કરે છે, અને આ પ્રક્રિયા NLRP3 બળતરાના સક્રિયકરણ પર આધારિત છે [53].N. caninum માટે, NLRP3 બળતરાનું પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન જાતિ-મધ્યસ્થી સક્રિયકરણ યજમાનમાં તેની પ્રતિકૃતિને મર્યાદિત કરે છે, જે તેને સંભવિત ઉપચારાત્મક લક્ષ્ય બનાવે છે [9].પેરાકોક્સિડિયોઇડ્સ બ્રાઝિલિએન્સિસ માઉસ બોન મેરોમાંથી મેળવેલા ડેંડ્રિટિક કોષોમાં NLRP3 બળતરાના સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરે છે, જેના પરિણામે બળતરા સાઇટોકિન IL-1β ના પ્રકાશન થાય છે, જે યજમાન સંરક્ષણ [10] માં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે.એલ. એમેઝોનેન્સિસ, એલ. મેજર, એલ. બ્રાઝિલિએન્સિસ અને એલ. ઇન્ફન્ટમ ચગાસી સહિતની કેટલીક લીશમેનિયા પ્રજાતિઓ મેક્રોફેજમાં એનએલઆરપી3 અને એએસસી-આશ્રિત કેસ્પેઝ-1 તેમજ લીશમેનિયા ચેપને સક્રિય કરે છે.NLRP3/ASC/caspase-1 જનીન [11] માં ઉંદરની ઉણપમાં પરોપજીવી પ્રતિકૃતિ વધારવામાં આવે છે.ઝામ્બોની એટ અલ.લીશમેનિયા ચેપ મેક્રોફેજેસમાં NLRP3 બળતરાના સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરે છે, જે અંતઃકોશિક પરોપજીવી પ્રતિકૃતિને મર્યાદિત કરે છે.આમ, લીશમેનિયા ટાળવાની વ્યૂહરચના તરીકે NLRP3 સક્રિયકરણને અટકાવી શકે છે.વિવો અભ્યાસમાં, NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ લીશમેનિયાને દૂર કરવામાં ફાળો આપે છે, પરંતુ પેશીઓને અસર કરતું નથી [54].તેનાથી વિપરિત, હેલ્મિન્થિયાસિસના અભ્યાસમાં, NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમના સક્રિયકરણથી હોસ્ટની જઠરાંત્રિય હેલ્મિન્થિયાસિસ [12] સામે રક્ષણાત્મક રોગપ્રતિકારક શક્તિને દબાવી દેવામાં આવે છે.શિગેલા એ મુખ્ય બેક્ટેરિયા છે જે વિશ્વભરમાં ઝાડાનું કારણ બને છે.આ બેક્ટેરિયા P2X7 રીસેપ્ટર-મધ્યસ્થી K+ પ્રવાહ, પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓ, લિસોસોમલ એસિડિફિકેશન અને મિટોકોન્ડ્રીયલ નુકસાન દ્વારા IL-1β ઉત્પાદનને પ્રેરિત કરી શકે છે.NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમ શિગેલા [55] સામે મેક્રોફેજની ફેગોસાયટોસિસ અને બેક્ટેરિયાનાશક પ્રવૃત્તિને નકારાત્મક રીતે નિયંત્રિત કરે છે.પ્લાઝમોડિયમના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે પ્લાઝમોડિયમથી સંક્રમિત AIM2, NLRP3 અથવા caspase-1 ની ઉણપ ઉચ્ચ સ્તરના પ્રકાર 1 ઇન્ટરફેરોનનું ઉત્પાદન કરે છે અને પ્લાઝમોડિયમ ચેપ [56] માટે વધુ પ્રતિરોધક છે.જો કે, ઉંદરમાં NLRP3 બળતરાના પેથોજેનિક સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરવામાં આલ્ફા-2 જિયાર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિનની ભૂમિકા અસ્પષ્ટ છે.
આ અભ્યાસમાં, MCC950 દ્વારા NLRP3 ઇન્ફ્લેમાસોમના નિષેધને કારણે BWમાં ઘટાડો થયો અને ઉંદરમાં આંતરડાના લેવેજ પ્રવાહીમાં ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યામાં વધારો થયો, પરિણામે ડ્યુઓડીનલ પેશીઓમાં વધુ ગંભીર રોગવિજ્ઞાનવિષયક ફેરફારો થયા.આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7.3 ગિઆર્ડિન યજમાન માઉસ NLRP3 બળતરાને સક્રિય કરે છે, માઉસના શરીરનું વજન વધારે છે, આંતરડાના લેવેજ પ્રવાહીમાં ટ્રોફોઝોઇટ્સની સંખ્યા ઘટાડે છે અને પેથોલોજીકલ ડ્યુઓડેનલ જખમને દૂર કરે છે.આ પરિણામો સૂચવે છે કે જી. ડ્યુઓડેનાલિસ આલ્ફા-2 ગિઆર્ડિન અને આલ્ફા-7,3 ગિઆર્ડિન દ્વારા એનએલઆરપી3 હોસ્ટ બળતરાને સક્રિય કરી શકે છે, જે ઉંદરમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસની રોગકારકતા ઘટાડે છે.
સામૂહિક રીતે, અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે આલ્ફા-2 અને આલ્ફા-7.3 જિયાર્ડિન NLRP3 હોસ્ટ ઇન્ફ્લેમાસોમના સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરે છે અને ઉંદરમાં જી. ડ્યુઓડેનાલિસની ચેપને ઘટાડે છે.તેથી, આ પરમાણુઓ ગિઆર્ડિઆસિસની રોકથામ માટે આશાસ્પદ લક્ષ્યો છે.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
લિયાંગ એકેએસ, લિયાંગ એએએમ, હુઆંગ એએચસી, સેર્ગી કેએમ, કામ જેકેએમ.ગિઆર્ડિઆસિસ: એક વિહંગાવલોકન.તાજેતરમાં જ બહાર આવ્યું હતું કે પેટ ઇન્ફ્લેમને દવાઓથી એલર્જી છે.2019;13:134–43.
એસ્કોબેડો એએ, સિમરમેન એસ. ગિઆર્ડિઆસિસ: ફાર્માકોથેરાપીની સમીક્ષા.ફાર્માસિસ્ટનો નિષ્ણાત અભિપ્રાય.2007;8: 1885–902.
ટિયાન હુઆફેંગ, ચેન બિન, વેન જિયાનફેંગ.ગિઆર્ડિઆસિસ, ડ્રગ પ્રતિકાર અને નવા લક્ષ્યોની શોધ.ડિસઓર્ડર ડ્રગના લક્ષ્યોને ચેપ લગાડે છે.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, વગેરે NLRP3 દાહક અને દાહક રોગો.ઓક્સાઇડ મેડ સેલ લોંગેવ.2020;2020:4063562.
ચેન જીવાય, નુનેઝ જી. આંતરડાની બળતરા અને કેન્સરમાં બળતરાની ભૂમિકા.ગેસ્ટ્રોએન્ટેરોલોજી.2011;141:1986-99.
પેલેગ્રિની સી, ​​એન્ટોનિઓલી એલ, લોપેઝ-કાસ્ટેજોન જી, બ્લાન્ડિઝી સી, ​​ફોરનાઈ એમ. કેનોનિકલ અને એટીપિકલ એનએલઆરપી3 ઇમ્યુન ટોલરન્સ અને ગટ ઇન્ફ્લેમેશનના ક્રોસરોડ્સ પર બળતરાયુક્ત સક્રિયકરણ.પૂર્વ રોગપ્રતિકારક.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.આરઓએસ-મધ્યસ્થી NLRP3 બળતરા સક્રિયકરણ એન. કેનિનમ ચેપના પ્રતિભાવમાં સામેલ છે.પરોપજીવી વેક્ટર.2020; 13:449.